组织深低温冻存中保护剂的应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.18.021

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (18): 3381-3388.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.18.021

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组织深低温冻存中保护剂的应用

张哲平1，张树明²

1辽宁医学院解放军第二炮兵总医院研究生基地，北京市 100088
2解放军第二炮兵总医院骨科，北京市 100088

收稿日期:2013-02-28 修回日期:2013-03-04 出版日期:2013-04-30 发布日期:2013-04-30
通讯作者: 张树明，教授，硕士生导师，主任医师，解放军第二炮兵总医院骨科，北京市 100088 zsmep@tom.com
作者简介:张哲平★，男，1987年生，北京市人，汉族，辽宁医学院在读硕士，医师，主要从事骨外科方面的研究。 zhangzheping@139.com

Cryoprotectant used in tissue cryopreservation

Zhang Zhe-ping¹, Zhang Shu-ming²

1 Graduate Base, the Second Artillery General Hospital of PLA, Liaoning Medical University, Beijing 100088, China
2 Department of Orthopedics, the Second Artillery General Hospital of PLA, Beijing 100088, China

Received:2013-02-28 Revised:2013-03-04 Online:2013-04-30 Published:2013-04-30
Contact: Zhang Shu-ming, Professor, Master’s supervisor, Chief physician, Department of Orthopedics, the Second Artiller General Hospital of PLA, Beijing 100088, China zsmep@tom.com
About author:Zhang Zhe-ping★, Studying for master’s degree, Physician, Graduate Base, the Second Artillery General Hospital of PLA, Liaoning Medical University, Beijing 100088, China zhangzheping@139.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：深低温冻存可以使离体组织的活性及功能最大限度的保留，对医学研究、临床治疗起到巨大的推动作用。但在复合组织深低温冻存中，保护剂及应用还存在着很多问题有待解决。
目的：综述近年国内外深低温冻存中保护剂应用的研究进展。
方法：第一作者应用计算机检索2003年1月至2012年12月PubMed数据库、中国期刊全文数据库、万方数据库相关文章，英文检索词为“cryopreservation，cryoprotectant，composite tissues，vitrification，transplantation”；中文检索词为“深低温保存，保护剂，复合组织，玻璃化，移植”。共检索到143篇相关文献，67篇文献符合纳入标准。
结果与结论：自上世纪开始国内外许多学者经过大量动物细胞和组织的基础实验研究，不断探寻各种细胞组织的冻存方法，采用了多种多样的冻存技术，使用的保护剂种类繁多，取得一定的研究成果，发现保护剂的应用在深低温组织冻存中起到了至关重要的作用，深低温冻存在组织工程、生殖医学、移植等领域已有广泛的应用。但目前复合组织深低温冻存保护剂的应用尚处于研究阶段，保护剂的种类、浓度以及导入洗脱方法均直接影响最终组织保存的成败。

关键词: 器官移植, 器官移植综述, 深低温保存, 复合组织, 玻璃化, 保护剂, 复温, 降温, 断肢再植, 异体移植, 渗透性损伤, 研究进展

Abstract:

BACKGROUND: Cryopreservation can preserve the activity and function of the in vitro tissues in the greatest degree, which create the enormous push and facilitation effect in medical research and clinical treatment. But in the composite tissue cryopreservation, there also has many problems in the application of cryoprotectant waiting for solve.
OBJECTIVE: To review the domestic and foreign research progress in the application of cryoprotectant in tissue cryopreservation
METHODS: The PubMed database, Chinese journal full-text database and Wanfang database were searched by the first author for the literatures published from January 2003 to December 2012. The key words were “cryopreservation, cryoprotectant, composite tissues, vitrification, transplantation” in Chinese and English. Totally 143 relevant literatures were collected, and 56 of them were in accordance with the inclusion criteria.
RESULTS AND CONCLUSION: Since the beginning of the last century, domestic and overseas experts have made great efforts on the research of tissue cryopreservation through a lot of fundamental experimental researches of animal cells and tissues, and variety of cryopreservation techniques and various cryoprotectants were applied and obtained a certain achievements, it found that the application of cryoprotectant played a crucial role in tissue cryopreservation. Cryopreservation is widely applied in some domains, such as tissue engineering, reproductive medicine and transplantation field. But at present, the application of cryoprotectant in composite tissue cryopreservation is still under studying in laboratory. The types and concentrations of cryoprotectant, as well as the addition and elution process can directly determine the ultimate success of cryopreservation.

Key words: organ transplantation, organ transplantation review, cryopreservation, composite tissue, vitrification, cryoprotectant agent, rewarming, cooling, limb replantation, allograft, permeability injury, research progress

中图分类号:

R318

张哲平，张树明. 组织深低温冻存中保护剂的应用[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(18): 3381-3388.

Zhang Zhe-ping, Zhang Shu-ming. Cryoprotectant used in tissue cryopreservation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(18): 3381-3388.

图/表（结果） 1

2.1 低温保护剂的应用 低温保护剂是应用在深低温冷冻过程中，起到保护细胞及组织避免低温冷冻过程中损伤的一种溶剂，可以应用不同比例的化学成分配置成溶液使用。对于绝大多数细胞组织来讲，在不使用低温保护剂的情况下，均无法抵抗深低温所带来的损伤。1972年，Mazur等^[1]首先从中国仓鼠组织培养细胞低温保存的实验中，提出冷冻损伤的两因素假说。一是由于过快冷却所产生的胞内冰晶导致细胞损伤，冷却速率越快，细胞内冰晶形成越多越容易导致此损伤；另一个因素是由过慢冷却所产生的溶质损伤所造成，冷却速率越慢，导致细胞外溶质浓度升高，产生细胞内外渗透压差，随之细胞脱水细胞内渗透压上升，导致细胞损伤越大。

从最初的1949年Polge等^[2]发现在精子的低温保存中加入甘油能明显提高其存活率，直到后来人们又发现目前已被人们熟知的二甲基亚砜可作为更好的冷冻保护剂，人们一直没有停下寻找更合适的低温保护剂的脚步。到目前已有几十种保护剂被发现，并且还可以根据不同的浓度配比来联合使用如常用的玻璃化溶液等，这些保护剂被广泛的应用到各个相关领域。

2.2 低温保护剂的种类 保护剂的种类按照是否能渗透到细胞内通常将其分为渗透性和非渗透性两种。

2.2.1 渗透性保护剂主要有二甲基亚砜、甘油、丙二醇、乙二醇等等。其特性在于保护剂的小分子结构在溶液中易结合水分子发生水合作用，增加溶液的黏性，从而在降温的过程中减缓水分子结晶形成，减小“胞内冰晶损伤”，来达到保护细胞、组织的目的。同时冷冻保存过程中加入渗透性保护剂可稀释溶液中溶质的浓度。这种保护剂可以渗透入细胞，改变了细胞内过冷状态，减小降温过程中因结晶造成的细胞内外渗透压差，减小了“溶质损伤”，也降低了冷冻过程中细胞脱水引起的皱缩程度和速度。相应的在复温过程中，其渗透性的特点可缓解渗透性肿胀引起的细胞及组织的损伤。缺点是为达到较好的玻璃化冻存需较高的浓度，在保护剂导入及洗脱过程中对细胞及组织有毒性损害。

2.2.2 非渗透性冷冻保护剂主要包括聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、海藻糖、羟乙基淀粉等等。乙烯吡咯烷酮、羟乙基等为大分子非渗透性物质，虽能溶于水但不能自由进出细胞，其加入到溶液后可以使溶液呈过冷状态，抑制冰晶形成。可以使特定温度电解质的浓度降低，减小溶质损伤，并通过改变渗透压引起细胞脱水减小胞内冰晶形成，从而起到保护作用。在降温过程中，此类保护剂主要与渗透性保护剂联合使用，促使细胞完成脱水，同时可以减少渗透性保护剂的使用浓度来减少毒性损害。复温时，其可以提供一个高渗透压的环境，防止过多水分进入细胞太快而引起细胞膨胀损伤。蔗糖、海藻糖为糖类非渗透性保护剂，同样可以促进细胞脱水。其中海藻糖不同于其他非渗透性保护剂的生物学特性使其具有特殊的保护机制，有研究证明其可以增加蛋白质折叠的稳定性，在耐受冷冻的组织中起抗冻作用，对细胞膜结构有保护性，通过“水替代”、“玻璃态”及“化学稳定性”3种机制发挥对组织低温保存更好的作用^[3-5]。

2.2.3 其他抗冻蛋白是一种不同于以上2类的新型低温保护剂。1971年Devrie成功的从一种鱼类体内分离提纯出一种抗冻蛋白。普遍认为其保护机制是因为它可以吸附在冰晶表面，阻止水分子聚集到冰晶上，从而抑制降温过程中冰晶的形成及复温时冰晶的再生成起到保护细胞的作用。但目前对其研究尚不明确，实际应用较少。

2.3 低温保护剂在冷冻、复温过程中的保护作用 低温保护剂的保护作用主要在降温及复温过程中体现，主要是针对冷冻损伤的因素起到相应的保护作用。其机制与化学结构密切相关，一般认为甲基的存在会很大地提高低温保护剂的玻璃态形成能力。由于保护剂含有羟基或其他极性基团，加入溶液后可以和水形成氢键，增加溶液的黏性，从而使水溶液中受扩散制约的冰晶形成过程变得缓慢，减弱冰晶的生长，降低溶液冰点温度，同时升高玻璃化转变温度，配合适当的降温、复温速率实现细胞及组织的深低温玻璃化保存。

2.3.1 降温在降温过程中由于上述特性显著降低了细胞内的冰晶形成，减轻了细胞外冰晶形成对溶液浓度的影响，从而既减轻了细胞内冰晶损伤，也减小了溶质损害。但是在降温过程中速率十分重要，除配合不同种类的保护剂及浓度外，还要控制恰当的速率才能将降温过程的损害降到最低，目前对降温方法还没有一致定论，对于组织保存多采取程序降温法。

2.3.2 复温有大量文献报道对复温过程进行了深入研究。保护剂在复温时作用与降温一致，所以复温速率成为关键。因为复温过程是降温过程的函数，所以最佳的复温方式需要配合不同降温方式来确定。复温过程中细胞面临反玻璃化过程，公认的理论是复温过程不能太慢，因为这样会造成细胞内冰晶再形成，或是将降温过程中胞内形成的小冰晶继续扩大而损伤细胞。而过快的降温或复温都会因为热应力变化造成组织的断裂^[6-7]，尤其是在大块或是复合组织的复温过程中更明显。有理论认为经程序冷冻保存的组织采用慢速复温效果更好^[8-9]，其理论是在程序降温过程中，细胞脱水，细胞内溶质浓度升高，最大程度上避免了细胞内形成冰晶，故复温时冰晶再形成就会减少。而过快复温反而加重了细胞凋亡及热应力导致的微断裂的产生，所以经程序冷冻保存的组织配合慢速复温过程，可以减小对细胞损伤，避免微断裂的产生。只有配合了合适的降温与复温过程，低温保护剂才能发挥其最佳的保护作用。

2.4 低温保护剂的损害与预防 玻璃化深低温冻存早在1937年就被提出，因为在玻璃化状态下，物质的结构成分可以稳定保持不变，所以被公认为是生物体保存的理想途径。而这其中保护剂的应用也带来了损伤问题。

2.4.1 毒性损伤因为目前的技术水平无法将降温速率达到即刻玻璃化转变的要求，所以需要配置高浓度的玻璃化保护溶液，增加其玻璃化特性，使生物材料更容易玻璃化保存。对于组织来说想要一步达到玻璃化深低温保存较难，所以目前组织低温保存的降温方法多是采用“两步法”或“程序法”达到深低温保存的要求。2种方法所能达到的实际效果是组织部分玻璃化，最大程度的将组织玻璃化保存，减少组织、细胞的损伤。而深低温保存中高浓度保护剂的应用对细胞及组织会形成较大的毒性作用，已有很多报道证实在生殖细胞玻璃化冻存中导致染色体的异常受精卵形成畸胎数增多。所以冻存过程中，需要既能减少毒性损伤，又能提高组织玻璃化程度的保护剂。

2.4.2 渗透损伤在降温之前，需要将保护剂的导入到组织内，同样在复温之后，因保护剂的毒性损害，需要将其洗脱出来。在这2个过程中，保护剂不再起到保护作用，除了毒性损伤外还能造成细胞膜两侧溶液浓度的不平衡，破坏细胞膜的半透性并对细胞造成不可逆的损伤。在导入洗脱过程中，由于细胞膜外溶液浓度的变化造成细胞脱水或肿胀超过一定限度时，也会造成组织不可逆损伤。所以在深低温保存过程中保护剂的导入和洗脱有着至关重要的作用^[10]，目前多应用梯度导入及洗脱方法，认为其对细胞膜内外渗透压差影响较小。

2.4.3 预防措施针对低温保护剂应用中带来的毒性损伤和渗透损伤，人们也不断的探索各种方法来寻求最大程度减小这些损害。

改善导入及洗脱方式可以减小渗透损伤：对于浓度较高的保护剂来说，一步导入常会对细胞造成严重损伤，目前高浓度保护剂的导入方式常常选择浓度梯度法，以多步导入的方式逐渐升高保护剂的浓度，使细胞及组织对高浓度的保护剂逐渐适应，不会产生细胞膜内外浓度突然的不平衡。关于梯度的设置则没有统一的定论。还有很多学者采用“连续导入法”，用以平衡组织内保护剂的浓度，Cui等^[11]在复合组织皮瓣低温保存的动物实验研究当中，设计了通过连续法进行导入及洗脱保护剂的装置。

低温环境可以减少保护剂对组织及细胞的毒性作用：为了减小毒性损害，可以在导入及洗脱过程中，控制浓度的同时控制导入时的温度。对于大块组织甚至是复合组织保存时，保护剂的导入时间较长也是组织损伤的一大原因，只有尽可能加快导入及洗脱过程，减少暴露时间才能尽量减少组织损伤。Soejima等^[12]在复合组织深低温保存的实验研究中，报道了通过“负压浸渍技术”加快保护剂的渗透来缩短导入时间，并在实验中取得了较好的保存效果。

其他：减小使用保护剂浓度可直接减少保护剂所致的毒性损害。其中高压可以提高玻璃化转变温度^[13]，从而可以减少保护剂使用浓度。还可以通过加入非渗透性保护剂促进溶液的玻璃化来减小渗透性保护剂浓度。另外可以通过加入不同种类的渗透性抗冻剂，利用他们之间的相互稀释，降低总毒性起到“毒性中和作用”。

保护剂能高效的促进冷冻体系向玻璃态的转变，同时减少对生物体的损伤是保护剂发展的关键。人们还需要探索适合的降温、复温过程，并研究高效的导入、洗脱方法，才能保证整个低温保存的成功。通过不断的研究人们探索出了一系列的“玻璃化溶液”，使细胞、组织乃至器官等范围广泛的生物体玻璃化深

低温保存成为可能。1985年Rall等^[14]提出了一种玻璃化溶液VS1，由20%DMSO、15.5%乙酰胺、10%丙烯二醇、6%聚乙二醇构成，使鼠胚胎玻璃化保存获得成功。Liebermann等^[15]用20% DMSO、20%EG、1 g/L聚乙二醇冷冻人卵和人胚分别获83.0%和86.8%的存活率。其他较常见的还有VS41a、VS55^[16]。

2.5 低温保护剂在不同组织中的特性及应用 保护剂除了自身特性外，其保护作用和损害毒性也因不同组织而异，不同细胞组织对不同保护剂的敏感性各不相同。王沛涛等^[17]研究发现PROH能够有效地保持平滑肌细胞的活性，并且对细胞的再生能力没有明显的损伤作用。Me₂SO损伤平滑肌细胞的再生能力,同时引起平滑肌细胞核染色质超微结构的变化。Aye等^[18]研究了二甲基亚砜、乙二醇和丙二醇三种保护剂用于卵母细胞玻璃化保存可能产生的基因毒性，结果表明DMSO不具有基因毒性，而乙二醇和丙二醇都表现出显著的基因毒性，引起仓鼠卵母细胞的DNA损坏和染色体断裂和突变。其次，不同的组织细胞对不同保护剂的渗透性亦各不相同，Baudot等^[19]曾经报道过乙二醇的保护效果在不同组织表现各不相同的特性。因此在深低温冻存保护剂的选择时，只有针对不同的细胞组织选取不同的的低温保护剂种类和浓度，才能达到最好的保护效果。

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引言

材料方法

讨论

器官移植是20世纪医学发展的重要成果，经过半个多世纪的临床实践已经成为治疗各种器官衰竭的重要手段，然而供体器官组织的切取、配型、保存、运输均需要时间，进一步开发更安全、更长效的保存液、保存方法提高供体器官质量成为了急待解决的问题之一。同时随着显微外科技术的发展，断肢、断指再植技术临床中应用已经非常广泛，但是断肢、断指再植对时限要求非常严格，常常因为伤后时间过长或因暂时不具备再植条件，离断肢体未得到良好保存而坏死，最终造成肢体缺损。或是严重的创伤后，断肢良好但患者全身状态不具备一期手术再植的机会造成遗憾。复合组织深低温冻存技术还可用于建立冰冻器官、肢体组织库，解决目前供体器官严重短缺问题。因此不断探索创新一种更长效的组织器官保存方法，开发研制更安全、特效的低温保存液，成为了医学界亟待解决的重要问题。复合组织深低温冻存将在器官移植、断肢(指)再植、组织工程、器官肢体组织库等领域显现他的重要作用。

纵观前辈们的研究与实践，目前复合组织玻璃化深低温保存技术尚不成熟，虽然在一些细胞及组织冻存中取得了一定的成果，并广泛用于组织工程、细胞生物等领域，但是针对大块复合组织的玻璃化深低温保存，尚未取得让人惊喜的成果。很多学者都在为之努力，如Cui等^[11]在复合组织深低温保存的初步研究中，应用DMSO结合海藻糖作为保护剂，将大鼠腹部带血管皮瓣自体再植1例成活63 d。王增涛等^[20]曾报道1例深低温保存81 d后断指再植成活。Bakhach^[21]对人类断指用DMSO低温保存后异种再植做了相关研究，这些研究不仅给了人们成功冷冻复合组织的希望，更为在接下来的探索中开阔了思路，提供了参考，从中也发现很多低温保存复合组织再植所面临的问题。单一组织不仅是简单细胞的聚合，复合组织也不同于多个单一组织的叠加。随着复合组织的体积增加，组织结构的复杂化，低温保存的难度也随之增加，每一个步骤所导致生物组织内部变化也更复杂。在温度变化过程中整块组织可能出现温度分布不均匀，降温过程中各个部位的冷却速率也会存在差异，各种组织有不同的热应力变化，对保护剂的敏感性及渗透性均不相同，低温保护剂的导入速度及分布也会受到很大影响。这些问题的存在造成最终复合组织的保存失败。复合组织器官中各种细胞的性质不同，但在冻存复温后它们还要作为一个整体发挥功能，所以需要保证组织内含有的各种细胞都保持良好活性才能保存住整个组织的功能。复合组织深低温保存的道路仍很漫长，为了探寻复合组织最好的冻存方法，除了需要毒性低、玻璃化特性好的高效保护剂外，应用中还需要配合恰当的降温及复温的方法、合理的保护剂导入及洗脱过程，这样才能最终成功的保存复合组织，并为成功的移植创造良好的条件。

目前复合组织深低温冻存尚处于动物实验研究阶段当中，多以大鼠或兔为实验对象，虽然实验研究投入颇多，但振奋人心的结果尚少见。细胞及一些单一组织冻存的成功为该课题提供了更多的理论支持，临床中个别案例应用取得的成功也给了人们继续探索的动力。对深低温保护剂的研究尚有很多的局限性，例如：保护剂有其不同组织特性，所以实验所得到的结果是否适用于临床还有待观察；对于不同大小、不同组织结构的复合组织其保存方法是否也一样，保护剂种类选择、浓度配比也仍需继续探索；还有就是自体组织保存成功后是否能更广泛地应用到异体再植中还有待于对于移植免疫研究的发展。这些都需要进一步的研究。潜心研制出一种特效、无毒，可长期使用的深低温冻存保护剂，使复合组织从切取直到移植术完成，能够确保移植物始终具有足够活力，维持复合组织长期存活，并能具有正常功能，甚至具有诱导特异性免疫耐受功能，复合组织深低温保护剂的研究具有极其广泛的应用前景，也将无疑是现代医学理论与实践研究具有里程碑的创举^[22-67]。

组织深低温冻存中保护剂的应用

Cryoprotectant used in tissue cryopreservation

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